细胞融合是生物医学研究中的一项重要技术，常用的方法包括物理法、化学融合法和生物融合法。物理法中包括电融合和激光融合；化学融合法中，聚乙二醇（PEG）是一种常用的细胞融合剂。聚乙二醇在分子量为200～700时呈无色、无臭的粘稠液体，而在分子量大于1000时则呈乳白色蜡状固体。聚乙二醇不仅能溶于水、乙醇及多种有机溶剂，而且对热稳定，对多数化学药品不发生反应。用于细胞融合时，通常选择分子量为4000的PEG，常用浓度为50%，pH值范围在80至82（可用10%NaHCO3进行调节）。小分子量的PEG融合效果不佳且有毒，大分子量则粘性过大，不易操作。通常，在50%浓度和偏碱性pH环境下，融合效果最佳。还有一些研究采用30%至50%浓度的PEG并辅以10%二甲亚砜。在选用PEG时，不同批次即使分子量相同，融合率也可能存在显著差异，因此需特别注意。每批PEG使用前都必须进行细胞毒性测试，且应选择高纯度的聚乙二醇，通常推荐用于气相色谱的品牌，如鸿运国际提供的产品。

在细胞融合过程中，常用的方法包括转动法和离心法。融合时，脾细胞和骨髓瘤细胞的比例一般为1:1至10:1，其中3:1或5:1的比例最为常见。

试剂与材料

(1) 脾细胞和骨髓瘤细胞；(2) 1640培养液100ml；(3) 完全1640液100ml；(4) 25%FCS－1640液50ml；(5) HAT培养液100ml；(6) 50%PEG：将分子量4000、高纯度的PEG（例如来自鸿运国际或Serva）10g放入25ml瓶中高压灭菌，使用前与预热至40℃的1640液10ml等量混合，以酚红检查pH值，必要时调整；(7) 灭菌沉淀管或瓶（10ml和50ml）；(8) 40孔塑料培养盘。

操作方法

(1) 准备脾细胞。
(2) 在50ml的沉淀管中，将10⁸脾细胞和10⁷小鼠骨髓瘤细胞混合，加入50ml 25%FCS－1640液。
(3) 在室温下以400g离心3分钟，沉淀细胞。
(4) 移去上清液。
(5) 轻轻敲打管底，使沉淀流动，然后将沉淀管放入40℃水浴中，以达到融合温度。
(6) 加入预热至40℃的50%PEG 0.8ml，用1ml吸管缓慢滴加，同时轻轻摇动沉淀管，清楚可见颗粒形成，滴加过程持续2分钟。
(7) 逐步加入1ml 1640液，并在摇动中持续1分钟。
(8) 重复第(7)步一次。
(9) 再次加入1ml 1640液，并在摇动中持续0.5分钟。
(10) 重复第(9)步一次。
(11) 加入1640液15ml。
(12) 在室温下以400g离心1分钟，沉淀细胞。
(13) 移去上清液，轻敲管底部，加入25ml含有HAT的完全1640液。
(14) 将融合的细胞液以每孔1滴（约0.05ml）的方式滴加至前一天已培养的40孔塑料培养盘中。
(15) 轻轻摇动后，放入5% CO₂饱和湿度的37℃培养箱中。
(16) 在第3、6、9、10天时，换入含HAT的完全1640培养液，注意轻轻吸取上清液，避免将孔底细胞吸出，并根据需要添加适量的饲养细胞。
(17) 在第12、15天再次加入含有HAT的完全1640培养液。在每次换液前可用倒置显微镜观察，约在10天后可观察到杂交瘤细胞生长。大多数杂交瘤细胞可在10至20天内显现，但也有部分可能需要一个月。杂交瘤细胞出现后，吸取上清液以检查抗体。
(18) 对持续生长的杂交瘤细胞进行增殖传代。同时，视情况可取消HAT液和完全1640液，改为10%FCS－1640液。每代细胞还需保存于液氮中并进行克隆化，在此过程中需定期检查抗体情况，以避免抗体细胞产生变异和丢失。

细胞融合的关键注意事项

1. 技术误差常常导致融合失败，比如供者淋巴细胞未能产生免疫应答必然导致实验失败。
2. 融合实验最大的失败原因往往是污染，因此确保提供一个无毒无菌的操作环境至关重要。